汤富酬、乔杰团队与合作者树立人类精子发生进
来源:潘长江网 发表于2019-07-17 15:52:50 编辑:冯小刚
摘要: 人类精子发作进程承载着将父源基因组遗传信息进行精准代际传递的使命,也是人类本身繁育和物种连续的重要保障。全世界约有10-15%的育龄夫妇存在不孕

人类精子发作进程承载着将父源基因组遗传信息进行精准代际传递的使命,也是人类本身繁育和物种连续的重要保障。全世界约有10-15%的育龄夫妇存在不孕不育的问题,其间,男性要素约占50%左右。说明人类精子发作进程中的基因表达调控机制是发育生物学的严重科学问题,对了解、确诊和医治男性不育相关疾病至关重要。

2019年8月30日,北京大学北京未来基因确诊高精尖立异中心、生命科学学院BIOPIC中心汤富酬课题组,北京大学第三医院乔杰课题组和南边医科大学赵小阳课题组,联合在世界闻名学术期刊Cell Stem Cell上在线宣布了题为“Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis”的研讨论文。该研讨初次从单细胞水平体系说明晰人类精子发作进程中的基因表达调控网络和细胞命运改变途径,制作了人类精子发作的高精度单细胞转录组图谱,解析了成年男性悉数生殖细胞类型及其要害的分子符号,并开端探究了将单细胞转录组技能用于人类非梗阻性无精症的研讨和确诊。

研讨团队首要别离并获取了正常成年男性和梗阻性无精症患者的2,854个睾丸安排细胞,对其进行了高精度的单细胞转录组测序剖析,并结合t-SNE、PCA和Monocle2等多种生物信息学剖析办法对这些数据进行深度发掘,在世界上初次完结了人类精子发作进程中的细胞命运改变和基因表达图谱的制作。在此根底上,研讨团队进一步对一例非梗阻性无精症患者的174个睾丸细胞进行研讨,承认了该无精症患者睾丸中的各种细胞类型及其与正常人睾丸中对应的细胞类型比较发作的基因表达反常,为男性不育的临床确诊供给了新的思路。

1. 人类精子发作进程中的细胞命运改变和基因表达动态

该研讨选取临床捐赠的成年男性睾丸安排为资料,经过随机选择或流式分选两种战略获取睾丸安排的单细胞样品,随后进行高精度单细胞转录组测序,并凭借核算生物学办法对单细胞转录组数据进行深度发掘(图1a)。经过非监督聚类剖析,研讨者发现在2,854个睾丸细胞中共存在17种不同的细胞类型,其间14种为各个分解阶段的睾丸生殖细胞,别的3种为睾丸微环境体细胞(图1b)。使用很多特异的标志基因对一切细胞类型进行身份判定,研讨者终究承认出3种精原细胞,包含精原干细胞(SSC)、分解中的精原细胞(Diff.ing SPG)、分解后的精原细胞(Diff.ed SPG),7种精母细胞,包含3种细线期精母细胞(L1~L3)、偶线期精母细胞(Z)、粗线期精母细胞(P)、双线期精母细胞(D)、割裂期初级精母细胞及次级精母细胞(SPC7),以及4种精子细胞(S1~S4)(图1c)。经过Monocle2对人类精子发作进程进行拟时刻发育剖析,发现由以上14种生殖细胞构成的发育途径与经典的生精上皮发育进程高度符合(图1d)。至此,该研讨初次凭借高精度单细胞转录组测序技能完好地描绘了人类精子发作进程中细胞命运改变的准确进程和基因表达改变的动态图谱,为进一步深度解析人类精子的发作进程奠定了重要的研讨根底。

?图1:人类精子发作的单细胞转录组图谱(a)研讨流程示意图;(b)17类睾丸细胞转录组的t-SNE剖析图;(c)人类生精进程中标志基因的动态表达改变图;(d)人类睾丸生殖细胞的拟时刻发育图

2. 人类精原细胞的自我更新、分解及参加的信号通路

根据t-SNE剖析,该研讨发现了3种人类精原细胞类型,经过剖析细胞类型特异的标志基因在3种精原细胞类型中的表达特征,发现精原干细胞高度富集了与自我更新调控相关的GFRA1、RET以及与干性保持相关的SALL4、UTF1等要害基因;而进入到下一个发育阶段(分解中的精原细胞),DMRT1、KIT等与精原分解相关的基因开端富集;终究在分解后的精原细胞中,减数割裂发动的标志分子STRA8开端高表达,标志着人类精原细胞正式发动减数割裂(图2a)。除了经典的RET信号通路,该研讨发现而且验证了BMPR1B与FGFR3为人类精原干细胞特异性表达的标志分子,也初次在精原干细胞中发现BMP与FGF信号通路从配体、受体到效应分子均出现高度富集的特色(图2b,2c)。这一成果标明,BMP和FGF信号通路很可能在人类精原干细胞的自我更新进程中发挥了要害作用。

?图2:精原细胞的基因表达调控(a)精原细胞阶段特异标志基因的表达热图;(b)睾丸安排BMPR1B、FGFR3的RNA原位杂交与DDX4的免疫荧光染色定位;(c)BMP、FGF信号通路要害基因的表达热图

3. 人类精母细胞的基因表达特征

精原细胞进入减数割裂并发育为各级精母细胞,在细线期与偶线期,同源重组相关基因DMC1、SPO11与联会复合体组分SYCP1、SYCP3、SYCE1等高度富集(图3a),标明该阶段正在高度有序地发作同源重组与同源染色体联会等重要的生物学事情,以保证减数割裂的正确发作。跟着粗线期(P)同源染色体配对与联会的完结,联会复合体逐步在双线期(D)开端崩溃,随后初级精母细胞进入割裂期,从而一分为二发作2个次级精母细胞(SPC7)。因为割裂期初级精母细胞与次级精母细胞发育进程十分时间短,其基因表达特征鲜有报导。在该研讨中,经过对各级精母细胞的基因表达特征进行精密剖析,并结合CCNA1/2、顶体素酶原(ACR)、γH2AX、DDX4等的表达特征(图3a,3b),初次完成了对人类割裂期初级精母细胞与次级精母细胞的身份承认,并承认了其全体水平上的基因表达特征。

?图3:精母细胞的基因表达调控(a)精母细胞阶段特异标志基因的表达热图;(b)ACR、TJP3的表达图;(c)CCNA1/2、PNA、γH2AX和DDX4在SPC7中的表达特征

4. 人类精子细胞的发育及其调控机制

1个四倍体的初级精母细胞会发作2个二倍体的次级精母细胞,并终究发作4个单倍体的精子细胞。随后,精子细胞需求经过鱼精蛋白转化、细胞质掉落、鞭毛生成等一系列的重要生物学改变,终究成为可游动的老练精子。在全体转录水平上,精子细胞从第一个阶段(S1)到第四个阶段(S4)出现转录本总量逐步下降的趋势,这标明精子老练进程伴跟着基因表达全体水平的下降。该研讨发现精子细胞阶段表达的基因可细分为4个类别,包含2类转录下调的基因,1类转录先上调然后下调的基因,以及1类表达上调的基因(图4a)。对这4类基因的深入研讨将有助于咱们了解人类精子老练的调控机制。

经过单细胞转录组剖析,研讨团队发现人类精子细胞可分为四种类型(S1~S4)。进一步经过DDX4、TNP1、PRM1、PNA等标志分子的蛋白表达特征,证明人类睾丸中存在上述四种精子细胞类型(图4b,4c)。

?图4:精子老练进程的基因表达调控(a)与人类精子细胞老练相关的4类基因;(b)精子细胞阶段特异标志基因的表达热图;(c)DDX4、TNP1、PRM1、PNA在人类精子细胞中的表达特征

5. 人类睾丸的体细胞微环境

t-SNE剖析发现人类睾丸中的体细胞首要分为三大类:支撑细胞(ST)、MIX细胞、以及睾丸巨噬细胞(tMφ)。支撑细胞中高度富集视黄酸组成相关基因(ALDH1A1),视黄酸经过旁排泄途径诱导精原细胞表达STRA8,使其进入减数割裂(图5a)。而MIX细胞在基因表达水平上存在较大的异质性,经过t-SNE对MIX进行从头分群,发现MIX包含表达INSL3、DLK1的间质细胞和表达MYH11、ACTA2的管周肌样细胞(图5b)。免疫荧光定位检测证明了人类睾丸安排中的体细胞微环境首要由支撑细胞、间质细胞、管周肌样细胞和睾丸巨噬细胞一起构成(图5c)。人类睾丸体细胞首要参加性激素组成、减数割裂的发动、细胞间的粘附与搬迁,以及睾丸内的免疫反响,尤其是睾丸巨噬细胞,这类很少被关注到的细胞类型将为探究人类睾丸微环境稳态的保持供给新的研讨思路。

?图5:睾丸体细胞的基因表达调控(a)人类睾丸体细胞标志基因的表达热图;(b)使用t-SNE对MIX进行从头分群,以及两个亚群中INSL3、DLK1、 MYH11和ACTA2的表达特征;(c)免疫荧光染色证明人类睾丸中存在4类体细胞

6. 单细胞转录组用于承认非梗阻性无精症患者的睾丸细胞类型和基因表达特征

人类睾丸的单细胞转录组图谱的制作,使研讨者对非梗阻性无精症的深入研讨成为可能。经过对一例非梗阻性无精症患者的174个睾丸细胞的单细胞转录组剖析,发现这些细胞首要聚类到睾丸体细胞类型中的支撑细胞和MIX细胞,对该例非梗阻性无精症患者的体细胞差异表达基因进行剖析,发现了包含BEX1、FATE1在内的一系列可能与该疾病发作相关的差异基因(图6b,6c)。使用Gene Ontology(GO)对差异基因进行剖析后发现,非梗阻性无精症患者的体细胞中高度富集细胞凋亡、氧化应激等生物学进程(图6d)。随后,免疫荧光染色成果证明了该例非梗阻性无精症患者睾丸安排中细胞凋亡表征显着。经过对该例无精症的探究,研讨者建立了根据单细胞转录组剖析的无精症分子确诊渠道,为研讨不育症致病机制和临床确诊供给了新的思路。

?图6:无精症睾丸细胞的基因表达调控(a)生精上皮完好男性的2,854个睾丸细胞及NOA患者的174个睾丸细胞组成的t-SNE图;(b)NOA患者与生精上皮完好男性支撑细胞的差异基因火山图;(c)NOA患者与生精上皮完好男性MIX细胞的差异基因火山图;(d)NOA患者的睾丸体细胞上调基因中富集的生物学进程

综上,该研讨在世界上初次成功制作了人类精子发作的高精度单细胞转录组图谱,为人类精子发作、减数割裂调控机制的研讨、无精症的分子确诊和临床医治供给了全新的视角。

北京大学博士生柳溪溪、陈依东,南边医科大学汪妹博士,深圳大学常港博士,以及广州医科大学隶属第三医院安庚博士为该论文的并列第一作者,北京大学汤富酬、乔杰和南边医科大学赵小阳教授为该论文的一起通讯作者。此项工作得到国家重点研制方案、国家自然科学基金、广东省科技方案、北京未来基因确诊高精尖立异中心以及我国博士后基金的支撑。

修改:白杨

 

汤富酬、乔杰团队与合作者树立人类精子发生进程高精度转录组图谱

 

汤富酬、乔杰团队与合作者树立人类精子发生进程高精度转录组图谱

 

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